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Sep 29, 2023

Microscopie à éclairage structuré en transmission avec éclairage à fréquence réglable utilisant un ensemble miroir inclinable

Scientific Reports volume 13, Numéro d'article : 1453 (2023) Citer cet article 2076 Accès aux détails de 4 Altmetric Metrics Nous présentons une démonstration expérimentale de la transmission assistée par miroir inclinable

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 1453 (2023) Citer cet article

2076 Accès

4 Altmétrique

Détails des métriques

Nous présentons une démonstration expérimentale de la microscopie à illumination structurée à transmission assistée par miroir incliné (tSIM) qui offre une imagerie super résolution à grand champ de vision. Un ensemble de miroirs inclinables conçus sur mesure est utilisé comme module d'éclairage où l'échantillon est excité par l'interférence de deux faisceaux réfléchis par la paire opposée de facettes du miroir. Des motifs structurés en fréquence accordable sont générés en modifiant l'angle d'inclinaison du miroir et la disposition hexagonale-symétrique est prise en compte pour la résolution isotrope dans trois orientations. L'utilisation d'un objectif à haute ouverture numérique (NA) dans la carte SIM standard offre un compromis de super-résolution avec le champ de vision (FOV). En utilisant une détection d'objectif à faible NA (20X/0,4), nous démontrons expérimentalement une image FOV unique de taille \(\sim\) (0,56 mm\(\times\)0,35 mm) avec \(\sim\)1,7- et \(\ sim\) Amélioration de la résolution par 2,4 (exploitant divers éclairages en réglant les miroirs inclinables) au-dessus de la limite de diffraction. Les résultats sont vérifiés aussi bien pour les billes fluorescentes que pour les échantillons biologiques. La géométrie tSIM découple les chemins d'éclairage et de collecte de lumière, permettant ainsi un changement libre de l'objectif d'imagerie sans influencer la fréquence spatiale du motif d'éclairage défini par les miroirs inclinables. Le champ de vision large et évolutif pris en charge par tSIM trouvera une utilisation dans les applications où la numérisation de grandes zones est nécessaire, comme en pathologie, et dans les applications où les images doivent être corrélées à la fois dans l'espace et dans le temps.

Briser la limite de diffraction1,2 de la microscopie à fluorescence classique au cours des deux dernières décennies a révolutionné les études biomédicales et a conduit à un nouveau domaine de recherche appelé « nanoscopie optique »3,4. Dans le domaine en évolution rapide de la nanoscopie, la microscopie à illumination structurée (SIM)5,6,7 apparaît comme une technique de super-résolution à grand champ importante dans laquelle une série de motifs structurés sont utilisés pour exciter l'échantillon fluorescent et les images de moiré brutes correspondantes sont traitées informatiquement pour obtenir une amélioration de résolution environ deux fois supérieure à la limite du champ large. Bien qu'elles offrent une amélioration de résolution relativement modérée par rapport aux autres techniques optiques de super-résolution, telles que la déplétion par émission stimulée (STED),8,9 la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM),10,11 la microscopie de localisation photo-activée (PALM), 12,13 ou appauvrissement de l’état fondamental (GSD),14,15 La SIM a attiré une attention considérable en raison de sa résolution spatio-temporelle élevée, de sa faible phototoxicité, de sa compatibilité avec le marquage fluorescent courant, de son imagerie multicolore efficace16,17, etc. Elle est également considérée comme une approche prometteuse pour l’étude de la dynamique sous-cellulaire des cellules vivantes18,19 en raison de son exigence d’un nombre moindre de trames brutes et d’une faible dose de photons. Bien que le modèle d’excitation structuré sinusoïdal soit la caractéristique clé pour obtenir une imagerie de résolution supérieure via SIM, il n’est plus limité aux modèles d’éclairage périodiques. Des illuminations aléatoires de type speckle20,21 avec des approches de reconstruction aveugle sont également mises en œuvre avec succès pour l'imagerie SIM. Cependant, les méthodes d'éclairage aléatoire offrent une super-résolution au prix d'une faible résolution temporelle en raison de l'exigence d'un grand nombre d'images (\(\sim\)100s). Ces méthodes effacent le thème principal de l’imagerie par illumination structurée périodique qui minimise le nombre requis d’images 9(15) dans les cas SIM 2D(3D), encore moins dans certains cas22,23 rapportés récemment. Par conséquent, les efforts visant à améliorer encore la résolution du SIM en conservant les modèles d’éclairage périodiques bien définis en valent la peine.

Dans la technique SIM linéaire conventionnelle, une seule lentille d’objectif est utilisée pour éclairer l’échantillon ainsi que pour collecter le signal de fluorescence. Par conséquent, l'optique d'éclairage et l'optique de détection sont limitées par la diffraction par la même lentille d'objectif, et le système est strictement limité pour offrir une amélioration de résolution double par rapport à la limite de diffraction classique. Afin de dépasser davantage la limite typique de résolution SIM, il existe une technologie fluorescente à réflexion interne totale (TIRF) -SIM24,25 dans laquelle le motif d'interférence haute fréquence des ondes évanescentes illumine l'échantillon. Cependant, l’éclairage TIRF est limité à une fine section optique (<100 nm) et ne concerne donc que l’imagerie 2D. En outre, les propriétés de saturation des matériaux fluorescents sont exploitées dans l’approche SIM non linéaire26,27,28 qui intègre les contributions de multiples harmoniques dans l’imagerie super-résolution. Cependant, la nécessité d’une intensité élevée pour atteindre le niveau de saturation de fonctionnement des fluorophores peut poser des problèmes de phototoxicité pour l’approche non linéaire. D'autres techniques SIM basées sur différents principes ont également été rapportées, par exemple plasmonique29,30, réseau de projection de proximité31 ou puce photonique32. Chacune de ces techniques nécessite des matériaux photoniques ou plasmoniques sophistiqués et dédiés pour manipuler le motif d'éclairage structuré dans le plan échantillon. De plus, des outils spécialement conçus sont nécessaires pour le déphasage et le changement d'orientation du motif, par exemple la thermo-optique pour la puce photonique SIM ou le galvo-balayage pour la SIM plasmonique. En général, ces techniques sont complexes du fait de leur dépendance au matériel dédié ; ce qui limite l'accordabilité de la fréquence du motif d'éclairage. Dans la SIM plasmonique, les structures de réseau pré-calibrées sont fabriquées en fonction de la plage de longueurs d'onde de fonctionnement. La structure spécifique détermine sélectivement l'orientation et la fréquence du motif d'éclairage, il n'y a pas d'accordabilité du motif. De même, dans la puce photonique SIM, la fréquence du motif d'éclairage est prédéterminée par les angles des bras de guide d'ondes disponibles. Enfin, les échantillons conventionnels sur des lames de microscope ou des lamelles ne fonctionnent pas pour ces méthodes. Il est nécessaire de préparer l'échantillon sur la surface du matériau conçu qui est éclairée par le motif d'interférence des ondes stationnaires en régime évanescent, limitant ces techniques à la super-résolution 2D-TIRF.