Blog

Jun 28, 2023

Comparaison des technologies alternatives de purification des vecteurs viraux

Par Jack Vicalvi, scientifique principal, J2 Biopharm Associates LLC Ceci est un aperçu de produits et d'approches innovants sélectionnés développés au cours des 15 dernières années qui ont contribué à

Par Jack Vicalvi, scientifique principal, J2 Biopharm Associates LLC

Il s'agit d'un aperçu de produits et d'approches innovants sélectionnés développés au cours des 15 dernières années qui ont contribué aux améliorations permettant la fabrication de vecteurs thérapeutiques viraux avec des taux de récupération et des puretés plus élevés.

Il s’agit de la deuxième partie d’une série consacrée à certaines avancées technologiques spécifiques en matière de purification. La première partie traitait des équipements et des processus en aval pour les anticorps monoclonaux.

Dans la deuxième partie, nous examinons comment ces produits peuvent changer la façon dont nous fabriquons ces vecteurs thérapeutiques viraux, où ils peuvent être utilisés dans les schémas de développement de processus actuels, et quels avantages ils confèrent par rapport aux méthodes précédentes. Nous abordons les situations économiques qui motivent l’utilisation de ces produits ou approches innovantes. Enfin, nous nous concentrons sur les modèles de mise à l'échelle GMP à des fins pratiques : s'ils ne sont pas mis à l'échelle selon les BPF, leur fonctionnement en développement n'a pas d'importance.

Diagrammes de flux de processus de vecteur viral

La clarification des récoltes de vecteurs viraux est plus compliquée que la clarification des mAb. La clarification traditionnelle commence généralement par une centrifugation différentielle ou par gradient. Cela peut, au mieux, être problématique pour la fabrication BPF à des échelles supérieures à 100 L, car la taille du lot de chargement des godets de centrifugeuse est généralement petite (10 à 20 L) ; Ensuite, il y a les problèmes de génération d'aérosols, de nettoyage et de validation, ainsi que les coûts d'équipement qui peuvent être un obstacle. Même avec une étape de centrifugation, une filtration en profondeur et une filtration stérile restent nécessaires. L’utilisation de filtres en profondeur chargés peut s’avérer intenable selon le virus, car la plupart des virus sont liés par des fragments de charge anionique. Cependant, en présence de 200 à 300 mM de NaCl, de nombreux virus ne seront pas éliminés par de tels dispositifs, alors qu'une partie du HCP et de l'ADN de la cellule hôte est toujours lié.

Les virus enveloppés tels que les lentivirus et les alphavirus sont plus labiles et peuvent ne pas bien résister à la filtration en profondeur. Cependant, les alphavirus sont plus robustes et peuvent se prêter à une filtration en profondeur normale, voire chargée. Dans ces cas, nous utilisons le Pall SupraCap 100 (4 à 2,1 µm), le Pall HCDII (1,2 µm) et l'AcroPak 500 (0,8 à 0,45 µm) en série. Les membranes Millipore DOHC, COHC et XOHC peuvent également être utilisées. L'utilisation de filtres de 0,2 µm entraîne généralement des pertes importantes et doit être évitée jusqu'à la filtration finale. Il est impératif de maintenir un système fermé aseptique pendant le traitement.

Les virus non enveloppés les plus populaires tels que les adénovirus (AV) et les virus adéno-associés (AAV) peuvent être clarifiés à l'aide des filtres en profondeur chargés 3M en présence de 180 à 250 mM de NaCl. Nous utilisons en série les filtres 05SP (10 à 2 µm) et 60SP (3 à 0,2 µm) pour les alphavirus non enveloppés et certains alphavirus enveloppés.

La méthode traditionnelle de capture de vecteurs viraux est l’AIEX. Ceci peut être réalisé en utilisant des résines ou des membranes. Pour les virus enveloppés, l’approche membranaire est généralement la meilleure car elle est beaucoup plus douce pour le virus que le chemin tortueux à travers une colonne remplie. Les appareils les plus couramment utilisés incluent le Pall Mustang Q, le Sartorius Sartobind Q-STIC et le monolithe BIA CIMultus. Le plus grand inconvénient des membranes ou des monolithes est leur faible capacité, ce qui entraîne la nécessité d'utiliser plusieurs cycles. Cependant, l’utilisation d’une colonne avec une hauteur de lit courte (6 à 10 cm) peut également fonctionner, avec l’avantage supplémentaire d’une capacité considérablement accrue par rapport aux membranes. Les virus non enveloppés couramment utilisés peuvent être capturés soit par des dispositifs à résine, soit par des dispositifs à membrane.

Une méthode alternative consiste à utiliser la chromatographie d'affinité. De nombreux virus ont des sites de liaison à l'héparine à leur surface, y compris les virus enveloppés. Nous avons eu du succès avec l'héparine HyperD comme étape de capture d'un alphavirus après digestion et clarification de la nucléase M-SAN, ce qui a permis une récupération >90 % avec une excellente élimination de l'ADNhc et une réduction significative de l'HCP lors de l'exécution de la colonne à 450 cm/h. Les résines céramiques HyperD sont fonctionnellement similaires aux résines de polystyrène. Il existe d'autres protocoles de purification qui incorporent le sulfate de cellufine ou le Capto DeVirS comme étape de capture initiale ; ces résines ont bien fonctionné dans la purification des flavivirus.