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May 02, 2024

Microscopie adaptative à contraste de phase pour compenser l'effet ménisque

Scientific Reports volume 13, Numéro d'article : 5785 (2023) Citer cet article 1055 Accès 1 Détails des métriques Altmetric Cet article a été mis à jour Le contraste de phase est l'un des plus importants

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 5785 (2023) Citer cet article

1055 Accès

1 Altmétrique

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Cet article a été mis à jour

Le contraste de phase est l’une des méthodes microscopiques les plus importantes pour rendre visibles des cellules transparentes et non colorées. Les cultures cellulaires sont souvent cultivées dans des plaques de microtitrage, constituées de plusieurs puits cylindriques. La tension superficielle du milieu de culture forme une lentille liquide à l’intérieur du puits, provoquant une défaillance des conditions de contraste de phase dans les zones marginales les plus incurvées, empêchant ainsi l’observation des cellules. La microscopie adaptative à contraste de phase est une méthode permettant d'augmenter fortement la zone observable en compensant optiquement l'effet ménisque. L'anneau du condenseur du microscope est remplacé par un écran LCD transmissif pour permettre des changements dynamiques. Un prisme déformable rempli de liquide est placé dans le trajet d'éclairage. L'angle de surface du prisme est incliné de manière adaptative pour réfracter la lumière transmise de sorte que l'angle tangentiel de la lentille liquide puisse être compensé. Outre l'observation de l'image en contraste de phase, un séparateur de faisceau permet de visualiser simultanément l'anneau du condenseur et le déplacement de l'anneau de phase. Des algorithmes analysent le déplacement pour ajuster dynamiquement l'écran LCD et le prisme afin de garantir des conditions de contraste de phase. Les expériences montrent une augmentation significative de la surface observable, en particulier pour les puits de petite taille. Pour les plaques à 96 puits, plus de douze fois la surface peut être examinée dans des conditions de contraste de phase au lieu de la microscopie à contraste de phase standard.

La microscopie à contraste de phase proposée pour la première fois en 1932 par Frits Zernike1 est une méthode largement utilisée pour observer des échantillons biologiques car elle peut rendre visibles des cellules transparentes et non colorées2. En raison des interférences, les déphasages de la lumière qui passe peuvent être rendus visibles pour augmenter le contraste des objets semi-transparents.

Cependant, ses applications sont limitées par l’effet ménisque, qui affecte particulièrement les échantillons en microplaques de 96 puits ou plus3. Les mesures de référence ont montré que dans les plaques à 6 puits, des conditions de contraste de phase peuvent être trouvées dans 25 % (235 mm2 sur 950 mm2) de la surface du puits. En plaques 96 puits, elle n'est que de 2,3 % (0,84 mm2 sur 36,3 mm2)4.

Le contraste de phase est une méthode de microscopie à lumière transmise dans laquelle un anneau de condensateur est placé sur le trajet du faisceau d'éclairage et la lumière dans l'objectif est guidée à travers un anneau de phase (voir Fig. 1). Si l'image de l'anneau du condenseur et l'anneau de phase se chevauchent, des conditions de contraste de phase apparaissent. Les déphasages se produisent au niveau des transitions dans l'échantillon observé, telles que les limites des cellules, qui sont mises en évidence optiquement. Les conditions de contraste de phase peuvent être facilement identifiées par l'effet « halo », qui est une région avec un fond sombre et des bords clairs autour des objets déphasés2,6.

Représentation schématique du trajet d'éclairage dans un microscope à contraste de phase avec différentes positions de puits. (A) Chemin de lumière simplifié à travers le microscope (les éléments non actifs tels que les miroirs de déviation et les plaques de verre ont été omis). (1) Source lumineuse (2) Anneau du condenseur (3) Lentille du condenseur (5) MTP (6) Lentille d'objectif (7) Anneau de phase (8) Miroir mobile (9) Lentille de Bertrand (10) Lentille oculaire (11) Caméra secondaire ( 12) Objectif tube (13) Caméra principale. En déplaçant le miroir (8), il peut être commuté entre le trajet lumineux principal (I) et le trajet lumineux secondaire (II) pour observer le chevauchement de l'anneau de phase et de l'anneau du condenseur. (B) La lumière traverse le centre du puits. (B.1) Image de superposition de l’anneau de phase et de l’anneau du condenseur. Ils se chevauchent complètement. (B.2) Image de contraste de phase résultante de la culture cellulaire. (C) En raison de la courbure de la surface vers le bord du puits, le faisceau lumineux est réfracté du centre. (C.1) Dans l'image de superposition, l'écart entre l'anneau du condenseur (2) et l'anneau de phase (7) est visible. (C.2) L’image cellulaire résultante est ainsi prise dans des conditions de fond clair. Les images (A.2) et (B.2) ont été prises avec un objectif 10x (Nikon CFI Plan Fluor DL ​​10XF) dans un MTP à 6 puits.